专家评论：低碳经济不能只是刮旋风

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柱2:5A分子筛柱，1/83m。以浓度氩为5.1（L/L），氮为4.1（L/L）气体标准物质为样品检测得到氩峰高为345.417mV，计算得到氩检出限为0.039（L/L）。

Ais是组分i标准品的峰面积。另一种分析方法是用吸附剂将氧除去，再用阀切割方法得到氩，但主成分氢气峰在气路切割时易干扰到氩组分，甚至氮组分也会出现在氢气拖尾峰上，影响氩和氮测量的准确性和重复性。在新能源汽车行业，对氢气纯度要求达到99.97%，其中组分氩、氮分别小于300（mol/mol)。研究设计了氧化反应装置，内部装有CuO2和Cu。（4）定量准确，重复性好。

氩保留时间tR1=7.16min，氮保留时间tR2=9.68min，则分离度R=2.2，相邻组分完全分离，且杂质峰峰形对称。利用氧化还原方法除去氢气，主组分对杂质无任何干扰，因此该方法优于中心切割方法。1.3仪器及设备倒置荧光显微镜，德国蔡司公司。

将枯草芽孢杆菌接种到LB琼脂培养基上，于37℃培养24h。将细胞壁重新悬浮于氢氟酸（5mg细胞壁悬浮于2mL48%HF）中，4℃处理48h。洗脱液分别是：A，40mmol/L磷酸钠（pH4.5）。冷冻离心机，日本日立公司。

色谱柱平衡柱子采用流动相A，柱温52℃，流速0.5mL/min，平衡1h。-淀粉酶、胰蛋白酶、变溶菌素，购买自美国Sigma公司。

之后将芽孢液放入80℃水浴中加热20min。胞壁肽是肽聚糖酶解后产物。取新鲜单菌落接种到适量的LB液体培养基中培养至OD600约1.0，离心收集菌体（8000g、4℃、10min），用冷的无菌去离子水清洗2次。如何将芽孢杀灭一直是食品杀菌领域亟待突破的关键问题。

现如今，国内还没有关于胞壁肽分离纯化的报道，也没有关于胞壁肽对芽孢萌发的影响研究。多功能酶标仪，瑞士帝肯公司。高效液相色谱，日本岛津公司。1.4.2芽孢平板计数将芽孢悬浮液进行梯度稀释，枯草芽孢杆菌芽孢采用营养琼脂培养基进行倾注平板计数，每个平板中加入1mL稀释菌液。

1.4.3芽孢萌发试验吸取适量芽孢液于离心管中，加入适量萌发剂。离心后除去上清液，获得的芽孢沉淀重悬于ACES缓冲液（0.05mol/L，pH7.0）中，最后用相差显微镜镜检，视野中95%的芽孢呈现明亮状方可使用。

革兰氏阴性菌和阳性菌的主要区别在第3个氨基酸，大多数阳性菌的第3个氨基酸是L-Lys。1.4.91HNMR将2mg冻干的GM-ＴriDAP样品溶于1mLD2O中，冷冻干燥并重复3次将糖肽中的活泼H置换，溶于0.5mLD2O中后置于核磁管中，核磁共振分析采用500兆核磁共振谱仪，室温20℃，500MHz作氢谱。

胞壁肽组分检测采用紫外检测器，波长为206nm1.4.6胞壁肽组分脱盐胞壁肽组分冻干后重新悬浮于无菌超纯水中，采用HPLC法进行脱盐，色谱柱为前述分离柱。因其独特的结构特性而对高温、高压、干燥、辐射、低温、腐蚀性物质等具有极强的抗性。平板计数计算芽孢萌发率。柱子采用0.007%（体积分数）三氟乙酸平衡，柱温35℃，流速1mL/min，胞壁肽采用50%甲醇（0.0025%三氟乙酸）线性梯度（0～100%）洗脱，洗脱时间在30～50min之间，胞壁肽组分检测采用紫外检测器，波长为206nm。500兆核磁共振谱仪，瑞士布鲁克公司。全扫描模式（MSScan）质谱条件：正离子（ESI+）数据采集模式产生准分子离子峰[M+H]+。

傅里叶变换红外光谱扫描仪，美国铂金埃尔默公司。1.5数据统计与分析所有试验均重复3次。

超高效液相-质谱联用仪，美国沃特世公司。胞壁肽还原采用新鲜配制的25mL，25mg/mLNaBH4，在加入过程中使pH保持在9.0。

放置在摇床中培养1h（37℃，200r/min）。芽孢是细菌在环境胁迫（如低温、干旱和营养缺乏等）下形成的休眠体。

SDS处理除去了菌体的其它蛋白质，非共价结合的脂蛋白和脂多糖。还原反应在室温中保持15min并不停地振荡，加入H3PO4使反应终止，将pH调至4。研究发现，当芽孢萌发后，其抗性消失，这也为杀灭芽孢提供了一个有效策略。将沉淀溶于无菌去离子水中均质破碎仪破碎细菌，不溶性细胞壁组分再通过离心收集（40000g，30min，25℃）。

最小的有效结构单元的胞壁肽为二糖三肽，其二聚体或三聚体依然能诱导芽孢萌发。收集的不溶性细胞壁进一步用-淀粉酶、胰蛋白酶进行酶解，以除去细胞壁上的糖原、共价结合的蛋白质。

1.4.5胞壁肽分离纯化将提取的肽聚糖悬浮于12.5mmol/L磷酸盐缓冲液（1mmol/LMgCl2，pH6.0，0.02%叠氮化钠）中，加入5g/mL变溶菌素，于37℃酶解24h。声明：本文所用图片、文字来源《中国食品学报》，版权归原作者所有。

现阶段杀灭芽孢主要是靠传统的高温、高压的方法，然而高温、高压在杀灭芽孢的同时，也会引起食品营养流失，口感、风味等品质的严重下降。将样品冻干，得到肽聚糖。

如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：肽聚糖，N-乙酰胞壁酸，三氟乙酸，枯草芽孢杆菌。1.4.4肽聚糖的提取采用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis168）的细胞壁提取肽聚糖。1.4.7三重四级杆串联质谱鉴定脱盐的胞壁肽组分采用三重四级杆串联质谱仪（QuattroMicro，Micromass）进行鉴定。1.2试验试剂LB液体培养基，北京索莱宝科技有限公司。

以上两步酶解均在缓冲液中进行（10mmol/LＴris-HCl，pH8.0），在胰蛋白酶中需要加入10mmol/LCaCl2。枯草芽孢杆菌芽孢在37℃条件下进行培养，培养24h。

如何在常温下杀灭芽孢一直是食品领域研究人员的一大挑战。1.4.8红外扫描光谱采用压片法将1.5mg冻干的GM-ＴriDAP与200mg干燥的KBr在玛瑙研钵中混合研磨均匀，置于磨具中，用压片机进行压片（压力为20～30MPa）1min，取下后得到透明的样品薄片，用傅里叶变换红外谱仪进行红外光谱的扫描，扫描范围4000～500cm-1。

1.4试验方法1.4.1枯草芽孢杆菌芽孢的制备菌种先用LB琼脂培养基活化3代以上，接入2SG培养基中涂板培养。将胞壁肽悬浮于100mL0.5mol/L的硼酸盐缓冲液（pH9.0）中